کلونینگ توالی کد کننده آنزیم دی-آمینو اسید اکسیداز کپک فوزاریوم در میزبان ساکارومایسس سرویزیه

دی-آمینواسید اکسیداز (daao) یک فلاووآنزیم پراکسیزومی حاوی فلاوین آدنین دی نوکلئوتید است که دآمیناسیون اکسیداتیو اسیدهای آمینه ی نوع دی را کاتالیز می کند. این آنزیم کاربرد های بسیاری در طراحی حس-گرهای زیستی، تولید آنتی بیوتیک سفالوسپورین cو چندین ترکیب ارزشمند دارویی و در تشخیص و پیشگیری چندین بیماری از جمله سرطان دارد. اگرچه این آنزیم ها به طور وسیع از میکروارگانیسم ها تا انسان گسترده اند، اما عموما آنزیم های میکروبی به دلیل وجود مزایای بسیار نیازهای صنعتی را رفع می کنند که در این میان جنس فوزاریوم جایگاه ویژه ای دارد. هدف از این مطالعه کلون سازی توالی نشانه ی ترشحی فاکتور آلفای مخمری به همراه ترادف کدکننده ی آنزیم دی-آمینواسید اکسیداز از منبع قارچ فوزاریوم اکسیسپوروم در میزبان یوکاریوتی ساکارومایسس سرویزیه به منظور بیان ترشحی آنزیم مورد نظر بود. پس از طراحی پرایمرهای اختصاصی، توالی نشانه فاکتور آلفای مخمری با استفاده از روش pcr تکثیر شد. قطعه ی تکثیر شده سپس در وکتور شاتل بیانی p316tdh3 کلون گردید. پس از تأ یید کلونینگ،cdna دی-آمینواسید اکسیداز با استفاده از پرایمرهای اختصاصی تکثیر شد. بررسی میزان هماهنگی کدون های مورد استفاده در cdna تکثیر شده در مقایسه با کدون های مورد استفاده در میزبان نشان داد که این پروتئین نمی تواند به طور موثر در میزبان ساکارومایسس بیان شود. از این رو پس از بهینه سازی کدون ها این قطعه سنتز شد و سپس در پلاسمیدp316tdh3 الحاق و در میزبانe.coli dh5? ترانسفورم گردید. پس از آن پلاسمید نوترکیب p316tdh3-?-matf-dao به میزبان ساکارومایسس سرویزیه منتقل شد. تعیین توالی قطعه سنتز شده صحت توالی و عدم وجود موتاسیون در آن را اثبات کرد. نتایج حاصل از کلونی pcr و برش های آنزیمی تأیید کننده کلون سازی قطعات در وکتور هدف می باشند.